Prevalencia de Cándida Dubliniensis en mucosa de pacientes VIH positivo y negativo en la Ciudad de Santo Domingo, República Dominicana.

*Noris Salcedo I, ** Rafael Isa Isa, ** Adolfo Arthur Nouel
Instituciones participantes: Instituto Dermatológico y Cirugía de Piel "Dr. Huberto Bogaert Díaz" (**), Centro Sanitario de Santo Domingo,  Hospital Salvador B.  Gautier, Instituto Dominicano de Estudios Virológicos,  Hospital Padre Billini, Laboratorio Veterinario Central.(*)

Resumen: Cándida dubliniensis, es un patógeno de cavidad oral de surgimiento reciente, fenotípicamente cercano a C. albicans, y con el cuál es fácilmente confundido. La finalidad del presente estudio fue evaluar la prevalencia de C. dubliniensis en mucosa (oral y vaginal) de pacientes positivos y negativos al VIH, utilizando cinco métodos fenotípicos: producción de clamidosporas en caseína agar, producción de tubos germinales en levadura peptona dextrosa (YEPD), crecimiento a 45 grados C., prueba de la Xilosa, y crecimiento en CHROMagar Cándida. La combinación de estos métodos fue usada para establecer la prevalencia de C. dubliniensis en una población de 75 (59%) de individuos infectados y 52 (41%) negativos.  De 75 infectados con el VIH, 53(71%) fueron positivos al hongo, y de 52 no infectados 14 (27%) resultaron positivos, identificándose como C. dubliniensis con  todos los métodos utilizados.
De un total de  88 pacientes a los cuales se les tomo muestras orales, 54(61%) resultaron positivos a C. dubiniensis, mientras que en región vaginal de 39  pacientes solo en 13 (33%) se aisló C. dubliniensis.
De 127 pacientes incluidos en este estudio solo 15 reportan que estaban bajo tratamiento: 8 con Fluconazol, de éstos, 5 tuvieron crecimiento a C. dubliniensis y 3 negativos. De los 6 que estaban siendo tratados con Ketoconazol , 5 resultaron con  C. dubliniensis.  El  otro paciente estaba usando Clotrimazol, el cual resultó positivo a C. dubliniensis.  Aquellos pacientes (3) usando antirretrovirales, en 1 de ellos se identificó C. dubliniensis, mientras que  2 resultaron negativos. De 12 que reportaron CD4, 5 estaban por debajo de 100 y se aisló C. dubliniensis en 3. De los 3 pacientes sin síntomas de candidosis , solo en 1 creció C. Dubliniensis, el cual cursaba 10 años con el VIH.
Todos los métodos fueron altamente susceptibles para la diferenciación de C. dubliniensis y C. albicans, siendo el medio de  CHROMagar cándida el más específico, sensible, rápido y confiable, en cultivos primarios.  

Introducción:

Cándida dubliniensis fue descrito por primera vez en Dublín en 1995 en aislamientos procedentes de pacientes infectados con el VIH. A pesar de que este hongo ha sido aislado principalmente en cavidad oral de individuos infectados en el VIH, el número de reportes en individuos sanos ha ido aumentando. En 1997 Coleman y Sullivan (1999), han reportado de un 18-32% en Irlanda. En 1998 en USA se reporto de un 11.17.5% y en individuos sanos alrededor de un 3%(12). En Brasil en Junio 2003 Priscila de Late y otros reportan un 81.8% de Cándida Dubliniensis en cavidad oral de individuos infectados (12). 1999 Meiller y otros reportan un 25% en cavidad oral (15).
Este hongo que principalmente coloniza cavidad oral en individuos infectados ha sido aislado también en sangre, esputo, vagina, orina, y materia fecal,(6,7,9,16) y que a veces puede causar enfermedad sistémica, es relativamente cercano y por lo tanto confundido en el laboratorio con Cándida albicans, por compartir características de diagnostico como son: la producción de clamidosporas, tubos germinales, con procedimientos de diagnósticos estándares, ciertas diferencias en su epidemiología  y en  ciertas características virulentas, y la habilidad de desarrollar resistencia in Vitro al Fluconazol (2,7,11,13,14). Por tal razón surge la inquietud de realizar una investigación de la prevalencia de Cándida dubliniensis en Santo Domingo en pacientes negativos y seropositivos al virus de Inmunodeficiencia Humana, con el objetivo de dar a conocer los resultados a  Médicos y Paramédicos  así como contribuir a una mejor calidad de vida en los pacientes que viven con el VIH.

Materiales y métodos:
Muestras Clínicas.

Se muestran 127 pacientes utilizando hisopos de la cavidad oral y/o vaginal de pacientes internos y externos de 5 centros de salud de Santo Domingo, RD; los cuales fueron evaluados para la presencia de Cándida dubliniensis. Las muestras orales fueron obtenidas del paladar, dorso medio de la lengua con un hisopo y enviadas al laboratorio para su identificación. De los pacientes muestreados, 85 (67%) fueron femeninos y 42 (33%) fueron masculinos; con los rangos de edades entre 3-75 años.

Casos clínicos: 

Candidiasis eritematosa por cándida dubliniensis	Candidiasis por cándida dubliniensis	Candidiasis eritematosa por cándida dubliniensis

Cada una de las muestras contenidas en solución salina fisiológica  fueron inoculadas en Sabouraud dextrosa agar y CHROMagar Cándida, luego incubadas a 37 grados Celsius por 24-48 horas para su crecimiento. Al final de este periodo se observaron las muestras para ver la presencia de levaduras y se procedió a su tipificación por los siguientes métodos: 

A-      Cultivo en CHROMagar Cándida.  

Las muestras en los hisopos fueron inoculadas en un medio cromogenico: CHORMagar Cándida (Becton Dickinson and Company Sparks, MD) en cajas de petri incubados a 37 grados C. por 48 horas. Las levaduras que fueron presuntivamente identificadas como Cándida dubliniensis fueron evaluadas con la prueba de germinación en tubos a 39 grados C. durante 30 minutos a 1 hora. Todas las levaduras con colonias con coloración verde oscura fueron consideradas sospechosas de C. dubliniensis, mientras que las colonias verdes claras como C. albicans (9,11,12).

B- Prueba de tubos germinales:
Una pequeña porción de la levadura era inoculada en un tubo conteniendo el medio YEPD (yeast peptona dextrosa) e incubada a 39 grados C. por ½ -1 hora. La formación de tubos germinales era observada al microscopio (X 40). Ambas especies: C. Dubliniensis y C. albicans producen estos tubos germinales (5)  

Tubos germinales en medio (YEPD)

C- Crecimiento a 45 grados: 
La habilidad de crecer a 45 grados fue probada por todos los aislamientos que eran tubos germinales positivos, utilizando una pequeña porción o colonia del crecimiento en CHROMagar Cándida (CAC). Y sembrando por agotamiento sobre placas de petri conteniendo Sabouraud dextrosa agar (SDA), los cuales fueron incubados a 37 grados C. y otra a 45 grados C. por 48 horas. La formación de colonias en el último tercer cuadrante del plato de petri era contado como buen crecimiento, mientras que en el primer cuadrante era considerado como pobre (9). 

D- Formación de Clamidosporas en Caseína Agar: 
Los aislamientos positivos a tubos germinales fueron probados para la producción de clamidosporas en caseína agar utilizando el método de Dalmau. Las colonias son inoculadas en el medio con una asa de platino, hiriendo el medio y luego cubriéndolo con un cubre objeto, e incubándose a 24 grados C. por 48 horas. Esto permite una simple diferenciación de Cándida albicans y de Cándida dubliniensis. Los platos son observados al microscopio donde se puede observar con objetivo de (X 40). Las clamidosporas de Cdublinienis son abundantes, dobles y triples, mientras que las de C. albicans son simples y escasas (9, 16). 

Clamidosporas de C. dubliniensis dobles y triples 

E- Prueba de la Xilosa 
Todos los aislamientos positivos a la prueba de formación de tubos germinales fueron sometidos a la prueba de asimilación de la xilosa. Una o dos colonias son inoculadas en un tubo conteniendo 2 ML. De Xilosa,  luego fueron incubadas por 24 horas. Un cambio de color a rosa fucsia es positivo lo cual es caracteristico de C. albicans, mientras que si no hay cambio en el color significa no asimilación del azucar que es el caso de C. dubliniensis (11). 

Resultados: 
Las 127 muestras de pacientes fueron tipificadas en los Laboratorios del Instituto Dermatológico EN Santo Domingo y en el Laboratorio Veterinario Central (LAVECEN), por los métodos ya descritos y los resultados obtenidos para las diferentes especies de Cándidas se observan en la figura 1. 

Los resultados de los individuos estudiados según la edad, sexo, positivos o negativos al VIH, y la región (oral o vaginal), en relación con la  frecuencia de Cándida dubliniensis en ellos encontrados se observan respectivamente en las figuras 2, 3 y 4 y 5.  

Discusión de los resultados: 
De acuerdo al grupo de edades entre 1- 18 años (1) positivo, entre  19-49,  C.dubliniensis se presentó en 57 casos,  lo cual era de esperarse pues según los diferentes autores citados C. Dubliniensis es hongo que abunda en pacientes VIH positivo la cual es una enfermedad de transmisión sexual y este es el grupo de edades de mayor actividad sexual.  Entre 50-64, solo en 5,  se aislo el hongo y en los de > = 65  solo se aislo C. Dubliniensis en (4) casos.  (Fig. 2).  
En cuanto al sexo de un total de 85 femeninos, 41 casos  resultaron positivos a C. Dubliniensis, mientras que los masculinos de 42, en 26 de estos hubo crecimiento del hongo. (Fig.3). 
En relación con los casos positivos al VIH de 75 pacientes en 53 (71%) se aisló C. dubliniensis, mientras que en 52 negativos al VIH, 14(27%) resultaron positivos, llegando a ser el total de aislamiento para C. dubliniensis 67. (Fig. 4). Este dato se encuentra dentro de lo reportado por diversos autores los que aseguran haber encontrado entre un 17 hasta un 81.8% de C. dubliniensis en pacientes con el VIH y en cavidad oral  (12). Es de particular interés en este estudio el alto porcentaje de pacientes negativos al VIH y que tuvieron aislamientos de C. dubliniensis; lo cual suponemos que muchos de estos pacientes podrían ser falsos negativos al VIH ya que se considero como negativo a los que no tenían el resultado de laboratorio.
Conforme a la Fig. 5, de 88 pacientes a los cuales se les tomo muestras en cavidad oral, 54(61%) resultaron positivos a C. dubliniensis, mientras que en región vaginal de 39  pacientes solo en 13(33%) se aisló C. dubliniensis, lo cual coincide con lo reportado por diversos autores de que en cavidad oral este hongo es mas frecuente (1, 3, 7, 9, 11,12).  

De los 127 pacientes incluidos en este estudio solo 15 estaban bajo tratamiento: 8 con Fluconazol, de estos 5 tuvieron crecimiento a C. dubliniensis y 3 no presentaron crecimiento. Lo cual coincide con la literatura citada de que algunos aislamientos de C. dubliniensis son resistentes al fluconazol y a otros azoles (2, 4, 6, 7, 8, 10, 11, 13,14) De los 6 que estaban siendo tratados con Ketoconazol, en 5 de ellos  creció el hongo.  El otro paciente estaba usando Clotrimazol como tratamiento, el cual resultó positivo a C. dubliniensis. De los que reportaron estar usando antirretrovirales (3),  2 fueron negativo y 1 positivo el cual cursaba 10 años con el VIH.   Algunos autores aseguran haber encontrado sensibilidad in vitro al fluconazol de algunas cepas (1,9), de C. Dubliniensis,  es evidente   por lo anteriormente que se refleja una resistencia a los antifúngicos aún desconocemos de si el de si el tratamiento estaba en su etapa inicial o final, por lo que recomendamos futuras investigaciones para determinar la frecuencia de la resistencia y/o sensibilidad a drogas en especímenes clínicos.  De 3 pacientes que no presentaron síntomas, solo en uno se aisló C. Dubliniensis.  De 12 pacientes que  reportaron tener resultados de CD4, de los 5 que estaban por debajo de 100, se aisló C. dubliniensis en 3, resultado éste de mucha importancia, pues mientras mas inmunodeprimido está el paciente mas es atacado por los hongos oportunistas, como es el caso de C. Dubliniensis.
De los métodos utilizados en el presente  para confirmación de C. Dubliniensis, solo el CHROMagar Cándida es por si solo, es el más específico, sensible, rápido. 

CONCLUSIONES 
C. dubliniensis ha emergido como una causa significativa de candidosis.  A pesar de que principalmente fue asociado con infecciones orales en pacientes infectados con el VIH, ha sido implicado en casos de enfermedades superficiales y profundas in individuos no infectados con el VIH.  En el presente estudio hemos  encontrado un alto porcentaje de C. dubliniensis 67 casos (53%) entre todos los pacientes muestreados.  Para confirmar el verdadero significado clínico de C. dubliniensis es claro la necesidad de futuras investigaciones epidemiológicas.  Esto va a ser facilitado por el reciente y  gran número de  pruebas de laboratorio confiables, rápidas, de fácil realización  y económicas que existen en la actualidad.   Recomendamos el uso del medio CHROMagar cándida, para la identificación presuntiva de C. dubliniensis, en cultivos primarios.  Cualquier colonia mostrando color verde oscuro debería ser examinada usando uno o más métodos: xilosa,  ausencia de crecimiento a 45 grados C., así como la  producción de clamidosporas en caseina agar.  Futuros estudios deberían ser realizados para determinar la frecuencia de la resistencia a los antifúngicos en aislamientos clínicos.  Tales estudios deberían ayudar a conocer algunas de  las razones por la que este hongo de recién surgimiento es causa de enfermedad en humanos. 

RECONOCIMIENTO  
Damos las gracias al Dr. Rafael Isa Isa, por apoyar la realización de este trabajo, y permitirnos el uso de las instalaciones del Instituto Dermatológico y Cirugía de Piel "Dr. Huberto Bogaert Díaz", que dignamente dirige, al  Dr. Eduardo Tió, Director General del LAVECEN, al Dr. Adolfo Arthur Nouel, por su entusiasmo y colaboración en el desarrollo de este trabajo, al Dr. Claudio Vólquez, Dra. José,  Dra. Ivelise Garris, Dra. Mónica Thormann, Dra. Ellen Koenig, Dr.  Gladstone Cumberbatch, a las estudiante Yesenia Peña y Nuria Gusi, por la toma de muestras a los pacientes del departamento de Estomatología, a la Lic. Teresa Rodríguez por su apoyo en el laboratorio clínico, y a todo aquel que de una u otra forma contribuyó a la realización de este trabajo. Este trabajo fue patrocinado en parte por FRANJA COMERCIAL, Santo Domingo.
Dirección de autor: Laboratorio Veterinario Central, ave. Monumental Los Girasoles, Santo Domingo, República Dominicana. TEL: 564-7700 (229). Fax: 560-0469. E-mail: salcedonoris@hotmail.com. 

REFERENCIAS
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2. Kantarcioglu AS, Yucel A. The presence of fluconazole-resitant Candida dubliniensis strains among candida albicans isolates from immunocompromised or otherwise debilities HIV-negative Turkish patients. Rev Iberoam Micol 2002 Mar,19(1):44-48.
3. Tekeli A, et all. Candida dubliniensis studies and isaolation of Candida types in oropharyngeal specimens from oncologic patients.Mikrobiyol Bul 2002 Jan;36(1):57-63.
4. Fisher JM. Identification of Candida dubliniensis in a HIV-positive South African population. SADJ 2001 Dec;56(12):599-601.
5. Kyoung-HoLee. The presuntive Identification of Candida albicans with Germ Tube Induce By Higt Temperature.Yonsei Medical Journal, vol. 40, No. 5,pp. 420-424, 1999.
6. Yang CW.Prevalence of candia species, including Candida dubliniensis, in Singapore.J Clin Microbiol 2003 jan,41(1):472-4.
7. MartinezM, Lopez-Ribot JK. Replacemente of Candida albicans with C. dubliniensis in human immunodeficiency virus-infected patients with oropharyngeal candidiasis treated with fluconazole.J Clin Microbiol. 2002 Sep; 40(9): 3135-9.
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10. Jose M.AguirreUrizar.Candidiasis orales.Rev Iberoam Micol 2002;19:17-21.
11. DerekJ.Sullivan, et all. Candida dubliniensis: An update. Rev Iberoam Micol 1999; 16;72-76.
12. Priscila de Laet.Candida dubliniensis in HIV negative and positive patient in Brazil Vol. 98(4) June 2003: 533-538.
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15. Meiller TF.  Oral Candida dubliniensis as a clinically important species in HIV-serotive patients in the Unites States..Oral Surg Med Oral Pathol oral Radiol 1999, Nov, 88(5):573-80.
16. Kikpatrick.WR. Detection of Candida dubliniensis in oropharyngeal samples from human immunodeficiency virus-infected patients in North America by primary CHROMagar candida screening and susceptibility testing of isolates. J clin Microbiol 1998. Oct;36(10):3007-12. 

Este trabajo fué presentado en Cartel en el: 
Xll CONGRESO DOMINICANO DE DERMATOLOGIA, que se celebro del   11 – 13  sept.     2003,   HOTEL  Coral  Canoa,  Bayahibe,  La  Romana,  R.D.  

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